蘋果銹果類病毒（ASSVd）酶聯(lián)免疫分析試劑盒實驗原理： 本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定標本中蘋果銹果類病毒（ASSVd）水平。用純化的蘋果銹果類病毒（ASSVd）抗體包被微孔板，制成固相抗體，可與樣品中蘋果銹果類病毒（ASSVd）相結合，經(jīng)洗滌除去未結合的抗原和其他成分后再與HRP標記的蘋果銹果類病毒（ASSVd）抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），與CUTOFF值相比較，從而判定標本中蘋果銹果類病毒（ASSVd） 的存在與否。 樣本處理及要求： 1. 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。 2. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。 3. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融. 4. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。 蘋果銹果類病毒（ASSVd）酶聯(lián)免疫分析試劑盒操作步驟： 編號：將樣品對應微孔按序編號，每板應設陰性對照2孔、陽性對照2孔、空白對照1孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同） 加樣：分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照50μl。然后在待測樣品孔先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻， 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。 配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液加蒸餾水至600ml后備用 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。 溫育：操作同3。 洗滌：操作同5。 顯色：每孔先加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。 測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。 結果判定： 試驗有效性：陽性對照孔平均值≥1.00; 陰性對照平均值≤0.10 臨界值（CUT OFF）計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.15 陰性判定：樣品OD值< 臨界值（CUT OFF）者為蘋果銹果類病毒（ASSVd）陰性 蘋果銹果類病毒（ASSVd）酶聯(lián)免疫分析試劑盒 陽性判定：樣品OD值≥ 臨界值（CUT OFF）者為蘋果銹果類病毒（ASSVd）陽性 |
