大鼠細胞色素C（CytC）ELISA試劑盒實驗原理
用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗該指標抗體的微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的抗該指標抗體、HRP標記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的該指標呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
試劑盒組成及試劑配制
1.酶聯(lián)板（Assay plate ）：一塊（96孔）。
2.標準品（Standard）：2瓶（凍干品）。
3.樣品稀釋液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶。
4.生物素標記抗體稀釋液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶。
5.辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 （HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶。
6.生物素標記抗體（Biotin-antibody）：1×120μl/瓶（1：100）
7.辣根過氧化物酶標記親和素（HRP-avidin）：1×120μl/瓶（1：100）
8.底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。
9.濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10.終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
大鼠細胞色素C（CytC）ELISA試劑盒標本的采集及保存
1.血清：全血標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
2.血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
3.細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
注：標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
操作步驟
實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。
1.加樣：分別設(shè)空白孔、標準孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μl，余孔分別加標準品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應120分鐘。
為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
2.棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標記抗體工作液100μl（取1μl生物素標記抗體加99μl生物素標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制），37℃,60分鐘。
3.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干。
4.每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液（同生物素標記抗體工作液） 100μl，37℃，60分鐘。
5.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干。
6.依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。
7.依序每孔加終止溶液50μl，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。
8.用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測。
注：
1. 用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。
2. 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。
3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標板加上蓋或覆膜。
4. 未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8℃保存。標準品、生物素標記抗體工作液、辣根過氧化物酶標記親和素工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復使用已稀釋過的標準品、生物素標記抗體工作液或、辣根過氧化物酶標記親和素工作液。
5. 建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準確性。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
計算 
以標準物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線，根
8. 不要用其它的試劑替換試劑盒中的試劑。
據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
注意事項
1. 當混合蛋白溶液時應盡量輕緩，避免起泡。
2. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
3. 一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4. 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。
5. 如標本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。
6. 在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。
7. 底物請避光保存。
8. 不要用其它的試劑替換試劑盒中的試劑。避光保存大鼠細胞色素C（CytC）ELISA試劑盒。